Arbeitstechniken für den sicheren
Supravitalnachweis pathogener
Mikroparasiten (Ca-Protozoen) und
ihrer Entwicklungsformen in frisch
entnommenen Blutproben
Dr. med. Alfons Weber
Die unentbehrlichen Arbeitsgeräte:
Ein leistungsfähiges Lichtmikroskop mit beheizbarem Objektträgertischchen.
Weitere unerläßliche Voraussetzungen für den Lebendnachweis pathogener Protozoen:
Durchschnittliche Kenntnisse auf dem Gebiet der mikroskopischen S-Vitalblutuntersuchung, das Beherrschen mehrerer zuverlässiger Arbeitsmethoden, mit deren Hilfe die mikroparasitären Zyklusformen der vorhandenen Population lebend nachgewiesen und der Grad der bestehenden Protozoämie bestimmt werden kann.
Der Direktnachweis (Lebendnachweis) der Mikroparasiten wird in folgender Reihenfolge geführt:
Im frisch gefertigten nativen Blutausstrich (1), in frisch entnommenen Bluttropfen (2), im frisch entnommenen Venenblut (3).
1. Der S-Vitalnachweis der Mikroparasiten im nativen Blutausstrich
Im nativen Blutausstrich gelingt der schnelle sichere S-Vitalnachweis der sehr resistenten, kleinen mikroparasitären Verbreitungsformen, die auch Dauerformen genannt werden.
Ihr Lebendnachweis gelingt auch in nativen luftgetrockneten Blutausstrichen, die tagelang gelagert worden sind.
Ich gebe hier nur sieben Arbeitstechniken an:
Jede der unter la—lg angegebenen sterilen Lösungen eignet sich für den sicheren S-Vitalnachweis der in den Extrazellularräumen des Blutausstriches gelegenen, überlebenden Mikroparasitenformen.
Beispiel
für die Fertigung eines S-Vitalpräparates (nach l a):
Kurzes Erhitzen des nativen Blutausstriches; dieser wird 3—4mal langsam durch die
Flamme gezogen (thermische Reizdosis für die im Blutfilm gelegenen, überlebenden Mikro-
parasitenformen).
Ausstrich auf + 30 — + 37 °C abkühlen lassen.
Mit steriler 1-ml-Spritze 0,3 ml sterile Natriumcitratlösung (Fresenius) und anschließend 0,7
ml sterile Ringer-Lösung (Fresenius) aufziehen.
Spritzeninhalt durch Schütteln gut mischen,
einen größeren Tropfen dieser Lösung auf den Blutausstrich bringen,
den Tropfen mit Deckgläschen zudecken,
mit ölimmersion bei eingestellter Ap.-Blende 2 bis 2,5 mikroskopieren.
Die Temperatur des Objektträgertischchens soll konstant + 30 bis + 37 °C betragen.
Lösg. la: Sterile Natriumcitratlösung 0,2 ml und sterile Ringer-Lösung 0,8 ml aufziehen; Natriumcitrat-Ringer-Lösungen l zu 3 und l zu 2 sind ebenfalls geeignet.
Lösg. lb: 0,3 ml sterile Natriumcitratlösung + 0,7 ml sterile isotonische Kochsalzlösung (Fresenius).
Lösg. lc: 0,2 ml sterile l%ige Essigsäure -l- 0,8 ml sterile Ringer-Lösung.
Lösg. ld: 0,1—0,2 ml Resochin (5%ige Lösung) + 0,9—0,8 ml Ringer-Lösung.
Lösg. le: 0,1 ml Chininum dihydrochloricum (Buchler) + 0,9 ml sterile Ringer-Lösung (Fresenius).
Lösg. lf: 0,1 ml Chinin, dihydrochloric. carbamidat. (Buchler) + 0,9 ml sterile Ringer-Lösung.
Lösg. lg: 0,04 ml steril. Hayems Reagenz (Merck) + 0,96 ml sterile Ringer-Lösung.
Der Ungeübte erkennt die kleinsten, an der Grenze der lichtmikroskopischen Sichtbarkeit stehenden mikroparasitären Verbreitungsformen nur mit Hilfe der elektronischen Kamera auf dem Bildschirm. Das geübte Auge erkennt diese winzig kleinen und agilen Mikroparasitenformen auch im Licht-Mikroskop, wenn ein transparentes, sehr dünnes S-Vitalblutpräparat gefertigt worden ist.
Fast in jedem der nach la bis lg gefertigten S-Vitalpräparate kann folgende aufschlussreiche Beobachtung gemacht werden: Viele Mikroparasiten befreien sich aktiv aus dem denaturierten Eiweiß des Blutplasmas. Es gelingt ihnen nur unter großen Anstrengungen (durch anhaltende Zappelbewegungen, durch lebhaftes, ruckartiges Hin- und Herbewegen), sich nach 30, 60, 120 oder mehr Sekunden vom Blutausstrich zu lösen und in die Flüssigkeit des SV-Präparates zu gelangen.
Die lebhafte aktive Eigenbewegung der „befreiten", aus dem Stadium der Hypobiose „erwachten" Mikroparasitenformen ist klar und deutlich zu sehen; Form und Größe der beobachteten Mikroben können ziemlich genau bestimmt werden.
Der S-Vitalnachweis der mikroparasitären Verbreitungsformen gelingt auch dann, wenn das S-Vitalpräparat nur mit Ringer-Lösung allein gefertigt und der Objektträger (vorher) nicht erhitzt wird. Vergleichende S-Vitaluntersuchungen führen jedoch eindrucksvoll vor Augen, dass der Grad einer bestehenden Mikroparasitämie, die Zahl der vorhandenen überlebenden Mikroparasitenformen durch die Applikation einer geeigneten thermischen oder (und) chemischen Reizdosis viel schneller und sehr viel genauer festgestellt werden kann.
2. Der S-Vitalnachweis der Mikroparasiten im frischen Bluttropfen
Ich führe diesen Nachweis im „ausgebreiteten" Tropfen. Der bestehende Protozoämiegrad, die Form und Gestalt der mikroparasitären Zyklusformen und Blutzellen lassen sich in der dünnen, zwischen Objektträger und Deckglas ausgebreiteten Blutschicht viel genauer beurteilen als im hängenden dicken Tropfen. In lege artis gefertigten S-Vitalblutpräparaten ist die Transparenz der zelligen und flüssigen Blutbestandteile größer; die Blutzellen liegen einzeln und nicht übereinander. Das Fertigen jedes S-Vitalblutpräparates erfolgt nach den strengen Regeln der Asepsis:
Die Entnahme der Bluttropfen erfolgt durch Einstich in die Fingerbeere oder Ohrläppchen. Mit einer graduierten 1-ml-Spritze, die eine der unter 2a bis 2i angegebenen Lösungen enthält, werden drei heraustretende Bluttropfen angesaugt; den hellroten Spritzeninhalt gut mischen, einen Tropfen des Spritzeninhaltes auf den sterilen Objektträger bringen. Das Deckglas wird mit der Fläche, die den sterilen Vaselinrand trägt, zum Tropfen hingeführt und dieser zugedeckt.
Das Deckglas sanft gegen den Objektträger drücken, eventuell übergequollene Blutsuspension mit Filterpapier aufsaugen.
Sofort mit ölimmersion und Ap.-Blende 2—3 mikroskopieren. Mit jeder der folgenden neun Lösungen, die unterschiedliche chemische Reizdosen enthalten, gelingt es, die Zyklusformen der vorhandenen Mikroparasitenpopulation (Merozoiten, Trophozoiten und Gameten) lebend nachzuweisen und zu filmen:
Lösg. 2a: 0,01 ml Resochin 5%ige Lös.: 0,96 ml steril. Ringer-Lösung
Lösg. 2b: 0,07 ml Resochin: 0,9 ml Ringer-Lösung
Lösg. 2c: 0,17 ml Resochin: 0,8 ml Ringer-Lösung
Lösg. 2d: 0,27 ml Resochin: 0,7 ml Ringer-Lösung
Lösg. 2e: 0,01 ml Chininum dihydrochloricum (Buchler): 0,96 ml Ringer-Lösung
Lösg. 2f: 0,02 ml Chininum dihydrochloricum: 0,95 ml Ringer-Lösung
Lösg. 2g: 0,01 ml steril. Hayems Reagenz (Merck): 0,96 ml Ringer-Lösung
Lösg. 2h: 0,01 ml Chininum dihydrochloricum carbamidatum (Buchler): 0,96 ml Ringer-Lösung
Lösg. 2i: 0.02 ml Chinin, dihydrochl. carbamid.: 0,95 ml Ringer-Lösung
In Supravitalblutpräparaten, die nach 2a bis 2i gefertigt werden, gelingt der zuverlässige S-Vitalnachweis extrazellulär gelegener, intraerythrozytär schmarotzender Mikroparasiten und der Lebendnachweis intra-phagozytär gespeicherter überlebender, mikroparasitärer Dauerformen.
Der S-Vitalnachweis der Mikroparasiten im entnommenen Venenblut
Mit einer graduierten Spritze werden 0,5 ml sterile Natriumcitratlösung, 5,0 ml sterile Ringer-Lösung und anschließend 4,5 ml Venenblut aufgezogen, der Spritzeninhalt gut gemischt.
Diese verdünnte Blutprobe reicht für die Fertigung mehrerer S-Vitalblutpräparate aus, wobei die unter 2a bis 2i angegebenen Lösungen verwendet werden können.
Beispiel:
nach 2b
Mit graduierter 1-ml-Spritze 0,07 ml Resochin, 0,9 sterile Ringer-Lösung und anschließend 0,3—0,4 ml des bereits verdünnten Venenblutes aufziehen, Spritzeninhalt durch Schütteln gut mischen,
von diesem einen Tropfen auf einen sterilen Objektträger bringen, steriles Deckglas auf den Tropfen kippen.
Mit Ölimmersion, Ap.-Blende 2—3, beheiztem Objektträgertisch (+30 - +37 °C) mikroskopieren.
In den vom Venenblut (nach 2a—2i) gefertigten S-Vitalblutpräparaten können die extrazellulär gelegenen und die intrazellulär gelegenen Mikroparasiten der vorhandenen Population lebend nachgewiesen werden.
Bevorzugt führe ich den S-Vitalnachweis der mikroparasitären Zyklusformen im verdünnten Venenblut, das (vor der Fertigung des SV-Präparates) der Zentrifugalbeschleunigung ausgesetzt worden ist. Die (mit Natriumcitrat- und Ringer-Lösung) verdünnte Venenblutprobe wird in ein steriles Zentrifugenröhrchen übertragen und 5 — 10 Min. lang zentrifugiert.
Das Zentrifugieren bietet einige Vorteile:
• Durch eine längere Einwirkung der Zentrifugalbeschleunigung werden Strukturen und Ultrastrukturen virulent infizierter und latent infizierter Blutzellen mehr oder weniger stark geschädigt, lokal zerstört. Es entstehen besonders in tödlich infizierten Zellen Mikrokavernen; in diesen Mikrokavernen virulent infizierter Phagozyten und Erythrozyten können oft intraplasmatisch gelegene überlebende Mikroparasitenformen vital beobachtet werden.
• Nicht selten wird durch eine längere Einwirkung der Zentrifugalbeschleunigung die Zellmembran
virulent infizierter Erythrozyten und Phagozyten gesprengt. Es kann beobachtet werden, dass die überlebenden Mikroparasiten die zerstörten Zellen verlassen und aktiv in die Extrazellularflüssigkeit schwimmen.
• Die in Erythrozyten gelegenen Mikroparasiten werden durch das Zentrifugieren z. Teil aus ihren
Wirtzellen heraus und in die Extrazellularflüssigkeit geschleudert, wo sie leichter nachweisbar sind.
• Das Zentrifugieren stellt einen stärkeren Reizfaktor dar, der bei den überlebenden Mikroparasiten eine auffallend lebhafte, „gereizte" aktive Eigenbewegung bewirkt.
• Ein 5 Minuten langes Zentrifugieren führt zur Anreicherung der extrazellulär gelegenen Mikroparasiten im Blutwasser, das über den sedimentierten Blutzellen steht. Dort können wir sie in großer Zahl lebend nachweisen.
Ist das Blutwasser (A) über den sedimentierten Blutzellen genügend transparent und dünnflüssig, so gelingt der S-Vitalnachweis der agilen Mikroparasiten im unverdünnten Blutwasser.
Mit einer 1-ml-Spritze einige Tropfen von A aufziehen, einen Tropfen davon auf den sterilen Objektträger bringen, S-Vitalpräparat fertigen, mikroskopieren.
Ist im Blutwasser (A) die geringste Trübung zu sehen, soll folgendermaßen verfahren werden:
Mit graduierter l ml-Spritze 0,7 ml steril. Ringer-Lösung und anschließend 0,3 ml des
Blutwassers aufziehen, Spritzeninhalt durch Schütteln gut mischen,
einen Tropfen des Inhaltes auf den Objektträger träufeln, S-Vitalpräparat fertigen und mikroskopieren.
Die mikroparasitär infizierten Erythrozyten, Phagozyten und Thrombozyten des zentrifugierten, verdünnten Venenblutes befinden sich unter der Masse der sedimentierten Blutzellen, im Sediment (B). Die S-Vitalbeobachtung dieser infizierten Blutzellen und der in ihnen gelegenen überlebenden Mikroparasiten ist von großer Bedeutung.
Um den sicheren Lebendnachweis der intrazellulär gelegenen überlebenden Mikroparasiten führen zu können, müssen B und A (die zelligen und nichtzelligen Bestandteile) des zentrifugierten Blutes durch längeres Schütteln gut gemischt werden.
Nach erfolgter Mischung Fertigen geeigneter S-Vitalblutpräparate nach den Methoden 2a bis 2i.
Beispiel: Mit graduierter l-ml-Spritze 0,17 ml Resochin (5%ige Lösung), nach 2c 0,80 ml sterile Ringer-Lösung, 0,03 ml vom gemischten Venenblut aufziehen,
Spritzeninhalt durch Schütteln gut mischen, einen Tropfen des Inhalts auf einen sterilen Objektträger geben, SV-Blutpräparat fertigen und sofort mikroskopieren.
Die nach 2a—2i gefertigten S-Vitalblutpräparate eignen sich nicht für längere, 14-, 24- oder 48stündige S-Vitalbeobachtungen.
Wer beabsichtigt, eingehende Langzeitstudien an überlebenden Mikroparasiten und Blutzellen zu betreiben, muss S-Vitalblutpräparate fertigen, die keine oder nur kleine, chemische (stimulierende) Reizdosen enthalten. Ich gebe hier nur 7, für eine Langzeitbeobachtung (L) geeignete Suspensionsmittel an:
Ll: Human. Blutplasma, z. B. Biseko; ein Teil Blut : 50—100 T. Biseko
L2: Steril. Ringer-Lösung; ein Teil Blut : 100 Teile der Lösung
L3: Steril. Hanks-Lösung; ein Teil Blut : 100 Teile Hanks-Lösg.
L4: Resochin-Ringer-Lösung 1: l 000; ein Teil Blut : 100 Teile der Lösung
L5: Resochin-Ringer-Lösung l: 10 000; ein Teil Blut : 100 Teile der Lösung
L6: Resochin-Ringer-Lösung l: 50 000; ein Teil Blut : 100 Teile der Lösung
L7: Resochin-Ringer-Lösung l: 100 000; ein Teil Blut : 100 Teile der Lösung